讨论：①溶剂的选择：只用用无水乙醇和无水甲醇才能得到满意的结果，其他溶剂因受到异烟肼盐酸盐在其中溶解度的限制不能采用。
②酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：当酸与异烟肼试剂的摩尔比为2：1时可获得最大吸收度。
③水分、温度、光线和氧的影响：当溶剂中含水量增高，吸收度随之降低。温度升高，反应加速。当在具塞玻管中不致使溶剂挥发及吸收水分的情况下，光与氧不影响反应。
④关于反应的专属性：具有Δ4-3-酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应。其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，因此在上述反应条件下，本法对Δ4-3-酮甾体具有一定的专属性。
5.Kober反应比色法Kober反应是指雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有最大吸收。
Kober反应有两步：①与硫酸-乙醇光热产生黄色，在465nm处有最大吸收;②加水或稀硫酸稀释，重新加热显桃红色，在515nm处有最大吸收。
中国药典采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺孕酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮滴丸中的炔雌醇的含量。
维生素类药物维生素A维生素A的结构为具有一个共轭多烯侧链的环己烯，因而具有许多立体异构体。
天然维生素A主要是全反式维生素A.性质：具紫外吸收，易氧化变质，能与三氯化锑呈色，与氯仿、乙醚、环己烷或是由醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。
鉴别试验
①三氯化锑反应(Carr-price反应)：维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。
②紫外吸收光谱：维生素A分子中含有5个共轭双键，其无水乙醇溶液在波长326nm处有最大吸收。当在演算催化下加热，则发生去水反应而生成脱水维生素A.后者比维生素A多一个共轭双键，使其最大吸收峰红移，同时在350～390nm波长范围内出现3个最大吸收峰。
③薄层色谱：以硅胶G为吸附剂，环己烷-乙醚(80：20)为流动相。
含量测定：紫外分光光度法(三点校正法)
原理：本法是在三个波长处测定吸收度，根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量，故本法亦称"三点校正法".原理如下：
①杂质的吸收在310～340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。
②物质对光的吸收具有加和性。
三点波长的选择法①第1点：选择维生素A的最大吸收波长(即λ1)。
②第2点和第3点：在最大吸收波长的两侧各选一点(即λ2和λ3)。
等波长差法：在λ1的左右各选一点为λ2和λ3，使λ3-λ1=λ1-λ2.维生素A醋酸酯。
等吸收法：在λ1的左右各选一点为λ2和λ3，使Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1.维生素A醇。
③维生素A2和维生素A3;维生素A的氧化产物(环氧化物、维生素A醛和维生素A酸);维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇;维生素A的异构体;合成时产生的中间体。
④测定方法：第一法(使用于维生素A醋酸酯)
取维生素A醋酸酯，精密称定，加环己烷制成每1ml中含9～15单位的溶液。然后在300、316、328、340、360nm五个波长处分别测定吸收值，确定最大吸收波长(应为328nm)。计算各波长下的吸收度与328nm波长下的吸收度的比值。
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